Laborjournal 2018-01/02

1-2/2018 | 67 METHODEN Formaldehyd war bei der Fixierung von Zellen für Immunfärbe-Experi- mente bisher nur schwer zu ersetzen. Mit Glyoxal fanden Göttinger For- scher jedoch eine echte Alternative. Pathologen fixieren ihre Proben und Gewe- beschnitte schon seit mehr als hundert Jah- renmit Formalin beziehungsweise Formalde- hyd. Aber auch Biologen halten Zellstrukturen mit Formaldehyd fest – etwa bei der Immun- färbung für die Fluoreszenz-Mikroskopie. Meist lösen sie dazu das pulverförmige Form- aldehyd-Polymer Paraformaldehyd (PFA) in einem schwach alkalischen Puffer, um eine Lösung mit vier Gewichtsprozenten Form- aldehyd zu erhalten. Besonders scharf auf den Umgang mit dem stechend riechenden PFA ist im Labor sicher niemand, zumal die Substanz nicht nur gesundheitlich bedenklich ist. In der Litera- tur finden sich zahlreiche Belege für experi- mentelle Probleme, die offensichtlich auf die Formaldehyd-Fixierung zurückzuführen sind. Dazu gehören zum Beispiel morphologische Veränderungen der Proben, verschwundene Epitope oder fehlgeleitete Zielproteine. Nur zu gerne würden viele Forscher des- halb auf das ungeliebte Formaldehyd verzich- ten, fanden bisher aber keine brauchbare Al- ternative. Ersatzstoffe wie Glutaraldehyd oder Methanol haben ebenfalls erheblicheMacken. Glutaraldehyd versperrt den verwendeten An- tikörpern häufig den Zugang zu den entspre- chenden Epitopen, und bei der Alkoholfixie- rung gehen schon mal cytosolische Proteine oder Membranen verloren. Eine Alternative musste her Für eine Gruppe um Silvio Rizzoli von der Universität Göttingen war deshalb klar, dass endlich eine moderne Fixiersubstanz her musste, die weder die Gesundheit derWissen- schaftler noch ihre Experimente negativ be- einflusst ( EMBO J 37(1):139-59). Bei ihrer Su- che nach Alternativen stieß die Gruppe ziem- lich schnell auf den Dialdehyd Glyoxal, den Zellfärber und Fluoreszenz-Mikroskopierer bislang konsequent ignoriert hatten. Rizzo- lis Mitarbeiter fanden ein einziges Paper aus den siebziger Jahren, bei demGlyoxal für Im- munfluoreszenz-Färbungen eingesetzt wur- de. Dazu kam noch ein versprengtes Häuf- lein Histologen, das Anfang des neuen Mille- niums ebenfalls mit Glyoxal als Fixierlösung experimentierte. Die meistenWissenschaftler hätten nach dieser nicht gerade ermutigenden Literaturre- cherche vermutlich die Finger davon gelassen, ausgerechnet Glyoxal als neue Fixierlösung auszuprobieren. Nicht so Rizzoli. Sein Team präparierte eine dreiprozentige Glyoxal-Lö- sung in Wasser, Ethanol sowie einem Schuss Essigsäure und untersuchte zunächst, bei wel- chem pH-Wert die Fixierlösung optimal funk- tionierte. Nach den Angaben der Gruppe war dies bei pH-Werten zwischen 4 und 5 der Fall. Zudem waren 10 bis 20 Prozent Ethanol in der Lösung nötig, um die Morphologie der fi- xierten Zellen zu erhalten. Fehlte der Alkohol oder war der pH-Wert zu hoch, änderte sich die Zellstruktur durch die Fixierung. Mit der optimierten Glyoxal-Lösung blieb dieMorphologie der Zellen dagegen genauso gut erhalten, wie bei einer parallel durchge- führten Formaldehyd-Fixierung. Glyoxal drang im Vergleich zu Formaldehyd aber schneller über dieMembranen in die Zellen ein. Die Zell- strukturen wurden hierdurch augenblicklich fixiert, wodurch den Zellen so gut wie keine Zeit für morphologischeVeränderungen blieb. Darüber hinaus führte Glyoxal auch zu einer schnelleren und vor allem stärkeren Vernet- zung von Proteinen. Nach diesen Vorversuchen war es Zeit, Glyoxal in praxisnahen Immunfärbe-Experi- menten auszuprobieren. Das Team exprimier- te hierzu fluoreszierende Reporter-Proteine für verschiedene Zellkompartimente, fixier- te die Zellen mit Glyoxal oder Formaldehyd und führte anschließend eine Immunfärbung durch. Auch hier überzeugte die Glyoxal-Fixie- rung und lieferte stärkere Fluoreszenzsignale. Abschließend testeten Rizzolis Mitarbeiter die Eignung der Glyoxal-Fixierung für die STED-Mikroskopie. Dazu fixierten sie Nerven- zellen in Glyoxal oder Formaldehyd, inkubier- ten die Proben mit verschiedenen Primär-An- tikörpern und gaben nach einem obligato- rischen Waschschritt einen entsprechenden Sekundär-Antikörper zu. Anschließend un- tersuchten die Forscher die Proben mit dem STED-Mikroskop. Das Ergebnis sprach auch hier für die Glyoxal-Fixierung. Sie führte nicht nur zu stärkeren Signalen sondern auch zu ei- ner etwas klareren Auflösung der Organellen. Auf Herz und Nieren getestet Rizzoli war inzwischen von der Glyoxal-Fi- xierung überzeugt und trommelte elf weitere Arbeitsgruppen zusammen, die die neue Fi- xierlösung in allen erdenklichen Anwendun- gen testen sollten. Einen großen Teil der Wis- senschaftler rekrutierte er in Göttingen, dar- unter Stefan Hells Gruppe, die Glyoxal bei Ex- perimentenmit dem 3D-STED-Mikroskop un- tersuchte. An dem groß angelegten Glyoxal- Test nahmen aber auch internationale Grup- pen teil, etwa das Team des Experten für syn- thetische Biologie Edward Boyden vomMas- sachusetts Institute of Technology oder Rory Duncans Gruppe vomEdingburgher Super-Re- solution Imaging Consortium . Alle kamen zum gleichen Schluss: Die Glyoxal-Fixierung lieferte in den meisten Fäl- len bessere Resultate bei Immunfärbungen als die Formaldehyd-Fixierung. Etwas schlechter schnitt sie nur bei Immunfärbe-Experimenten von Mitochondrien ab. Es gibt also endlich ei- ne echte Alternative zur Formaldehyd-Fixie- rung, die deutlichweniger gesundheitsschäd- lich ist und darüber hinaus zu besseren Fär- berergebnissen führt. Harald Zähringer Glyoxal-Fixierung Ich kenne da einen Trick... Sie kennen auch einen guten Labortrick? Für jeden abgedruckten Trick gibt‘s ein Laborjournal-T-Shirt. Bitte mailen Sie an: hz@laborjournal.de (Fotos von Trick &Tricklieferant erwünscht!)

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