Laborjournal 2018-01/02

| 1-2/2018 68 Methoden Um zu verstehen, welches Rädchen (Protein) in einem komplexen Getriebe (Zelle) welche Rolle spielt, schaut man sich am besten die „Was-wäre-ohne“-Situation an. Dafür gibt es prinzipiell drei Strategien: Den ursprünglichen Bauplan löschen, den Bauprozess blockieren oder das fertige Produkt im Nachhinein zer- stören. In Molekularbiologen-Sprache über- setzt heißt das: DNA-Knock-outs generieren, RNAi-Silencing initiieren oder Proteine degra- dieren. Bei den ersten beidenAnsätzen kommt man umgenetischeManipulationen nicht he- rum. Ohne Klonierungs- undTransformations­ aufwand läuft da nichts, und kurzfristigwirken- de, geschweige denn kontrollierbar reversib- le Eingriffe sind kaummöglich. Manchmal will man aber genau das: Ein endogenes Protein ratzfatz auf Kommando zum gewählten Entwicklungsstand entfernen, um beobach- ten zu können, wie Zellen, Zellstrukturen oder Signalwege auf den Verlust reagieren. Mit der neuen Trim-Away-Methode, die Melina Schuhs Gruppe von der Uni Göttingen zusammen mit Wissenschaftlern des MRC in Cambridge, England, entwickelte, wird dieser Wunsch Realität (siehe hierzu auch das Inter- view mit Melina Schuh auf Seite 69). Schuhs Mitarbeiter setzen auf Antikörper zur Erken- nung gewünschter Proteine und auf die Pro- teolyse für deren Beseitigung ( Cell 172: 1-15). Abbau in Windeseile DieTrim-Away-Technikmacht sich die zell- eigene Proteinabbau-Maschinerie zunutze und zerstört native Proteine binnen Minuten. So- mit bleibt für das Aufkeimen etwaiger unspe- zifischer Effekte kaum Zeit. ZumVergleich: In- duzierbare Gen- und Transkriptmanipulatio- nenwirken nur indirekt und zeitlich verzögert. Sie beseitigen zum Zeitpunkt X vorhandene Proteine nicht, sondern verhindern nur de- ren De-novo -Aufstockung. Stabile und in ho- her Zahl vorliegende Proteine reagieren ent- sprechend träge. Dagegen greift Trim-Away als akute Maß- nahme ein, bevor etwaige Kompensationsme- chanismen anspringen können. Ein weiterer Vorteil ist, dass auch sich nicht teilende Pri- märzellen auf die Manipulation ansprechen. Diese Zellen sind mit Methoden, die auf DNA und RNA abzielen, so gut wie unerreichbar. Gänzlich neu sind Konzepte zur induzier- ten Protein-Inaktivierung nicht, die bestehen- den haben aber einigen Optimierungsbedarf. So gibt es etwa Strategien, die eine vorheri- ge Modifikation des Zielproteins vorausset- zen, um es überhaupt manipulieren zu kön- nen. Andere kommen zwar ohne Modifika- tion aus, können aber nur auf eine Handvoll ausgewählter Kandidaten angewendet wer- den. Bestimmte Proteine mit chemischen In- hibitoren lahmzulegen, ist zwar eine ebenfalls sofort wirkende Maßnahme, doch vor Kolla- teralschäden ( Off-target -Effekte) ist sie nicht gefeit. Eine universell anwendbare Strategie fehlte bisher. SchuhsTeamsetzt bei derTrim-Away-Tech- nik auf die drei stärkstenTrümpfe von Antikör- pern: hohe Affinität und Spezifität sowie Flexi- bilität. Die Antikörper sollen aber nicht einfach nur ausgewählte Moleküle lahmlegen. Dafür müssten sie mit den endogenen Liganden ei- nen stöchiometrischen Konkurrenzkampf füh- ren, sich Zugang zummeist verborgenen Ziel- motiv verschaffen und in entsprechend gro- ßen Mengen vorliegen. Vielmehr heftet sich bei der Trim-Away-Strategie ein spezifischer Antikörper an sein Zielprotein undmarkiert es für den proteolytischen Abbau. Dreh- und An- gelpunkt ist die E3-Ubiquitin-Ligase TRIM21, die eine hohe Affinität zur Fc-Domäne von Antikörpern hat. TRIM21 ist die sonstige Ge- staltung des Antikörpers schnuppe, Hauptsa- che er hat eine Fc-Domäne. Die Ubiquitin-Ligase wird normalerweise von verschiedensten Zelltypen und Geweben exprimiert und spielt in der Pathogen-Abwehr eine Rolle. In natura trifft ein Pathogen auf kör- pereigene Antikörper, TRIM21 klammert sich an die Fc-Domäne und rekrutiert so die Anti- körper-gebundenen Pathogene zur zelleige- nen Ubiquitin-Proteasom Metzelei. Für einen ersten experimentellen Beweis, dass ihre Strategie funktioniert, nutzten die Forscher NIH 3T3-Zellen (Mausfibroblasten), die einmCherry-TRIM21-Konstrukt sowie GFP exprimierten. DenZellen verabreichten siemit- telsMikroinjektionAnti-GFP-Antikörper (bezie- hungsweise IgG als Kontrolle). Anschließend verfolgte die Gruppe den GFP-Abbau anhand von Zeitraffer-Aufnahmen mit dem Fluores- zenz-Mikroskop, kurz vor, und in fünfminüti- gen Intervallen nach der Mikroinjektion. Proteasom amWerk Nach 17 Minuten war bereits die Hälfte der GFPs zerkaut, nach einer Stunde waren kaum mehr welche übrig. Dass hier tatsäch- lich das zelleigene Proteasom werkelte, be- legten die Forscher in Parallelexperimenten mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 bezie- hungsweise DMSO (Kontrolle). Kontrollzellen erlitten das oben beschriebene Schicksal, in MG132-behandelten Zellen blieb GFP dage- gen heil; ebenso wie in Zellen mit einer de- fekten TRIM21-Variante. Post-mitotische Primärzellen „schlafen“ gewöhnlich, das heißt, sie sind transkripti- onell inaktiv und für Nukleinsäure-Manipu- lationen zur Beseitigung von Genprodukten nicht zugänglich. Sie horten zudemmeist gro- ße Proteinmengen, sodass RNAi-Eingriffe we- nig bringen. Für die TRIM-Away-Strategie ist der Dornröschenschlaf offenbar keine Hürde, denn ganz ähnlich wie die Fibroblasten re- agierten TRIM21-exprimierende Maus-Eizel- len auf die Antikörperinjektion mit einer flot- ten Abnahme des Zielproteins GFP. Um sicherzustellen, dass heikle Geschöp- fe wie Eizellen durch den Eingriff keine Ent- wicklungsstörungen davontragen, untersuch- te das Team eine etwaige Beeinflussung der Meiose. TRIM21-Überexprimierer blieben un- auffällig, der Zeitverlauf und die Effizienz ver- lief wie in den Kontrollzellen. mCherry-TRIM21 co-lokalisierte mit GFP, gemäß der Theorie, dass TRIM21 sich an (an- ti-GFP)-Antikörper und somit indirekt an GFP klammert. Interessanterweise kames nach der Antikörperinjektion aber nicht nur zum ge- wünschten Abbau des Zielproteins GFP. Auch mCherry-TRIM21 sowie die eingeschleusten Antikörper gingen sukzessive zugrunde. Hat man es mit einem besonders häufigen oder robusten Zielprotein zu tun, könnten die ein- Wer in der Vergangenheit Proteine ausschalten wollte, um ihre Funktion zu analysieren, musste den Umweg über das Genom oder die mRNA nehmen. Damit ist jetzt Schluss. Die Trim-Away-Methode markiert die ausgesuchten Proteine und liefert sie umgehend dem Häckselwerk des Proteasoms aus. Schnelles Ende für Proteine Neulich an der Bench (177): Proteinabbau mit Trim-Away

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