Laborjournal 2021-01

| 1-2/2021 68 Methoden Spiegeln starre 3D-Modelle von biologischen Makromolekülen dieWirklichkeit wider? Ver- staubten Schlüssel-Schloss-Prinzipien zufol- ge ja. Warum finden sich in der Hälfte aller humanen Proteine dann ungeordnete Regi- onen, die über simple Schleifen als Scharnie- re zwischen Sekundärstrukturelementen hi- nausgehen? Tatsächlich ist jedes dritte humane Pro- tein zu einemDrittel unstrukturiert. Intrinsisch ungeordnete Proteine verbringen ihr Dasein sogar komplett ungefaltet in einem dynami- schen Ensemble interkonvertierender Kon- formere ohne globales Energieminimum. Ei- ne traditionelle 3D-Architektur erwerben sie nur im enthalpisch oder entropisch favorisier- tenWechselspiel mit Interaktionspartnern. Ih- re Funktion lässt sich nicht mehr mit einfachen Schlüsseln und starren Schlössern erklären. Solche heterogenen Strukturen können weder kristallographisch noch kryoelektronen- mikroskopisch erfasst werden. Entweder wi- dersetzen sie sich der Kristallisation oder tra- gen nur zu einem Bruchteil zum Beugungs- muster bei. Als Konsequenz enthalten fünf- undsiebzig Prozent der Proteine in der Protein- datenbank ( rcsb.org ) Bereiche ohne Elektro- nendichte ( J. Biomol. Struct. Dyn. 24(4): 325-42). Proteindynamik wird sichtbar Das einzige biophysikalische Verfahren, das sowohl über Struktur als auch Dynamik aufklärt, ist die Kernspinresonanzspektrosko- pie (NMR). Sie beleuchtet Phänomene auf ei- ner Zeitskala von Pikosekunden bis Minuten: von der Diffusion vonMegadalton-Komplexen über allosterische Konformationsänderungen bis zur Vibration chemischer Bindungen. Die Summe aller NMR-Observablen macht in der Theorie die Enthalpie- und Entropiebeiträge jedes Atoms zur Thermodynamik und Kinetik des Gesamtsystems zugänglich. Rasmus Linser und seine Arbeitsgruppe in der Physikalischen Chemie der Technischen Universität DortmundentwickelnNMR-Metho- den, die über starre Grundzustände hinausbli- cken: „Die Mitglieder einer Familie verwand- ter Proteine verfügen über ähnliche enzyma- tisch aktiveTaschen. Ein Familienmitglied kann deshalb oft nicht selektiv über diese adressiert werden, sondern Interaktionspartner müssen allosterisch agieren. Hierfür verwendet die Na- tur manchmal Minderheitenkonformere, die im Konformationsensemble des Proteins sel- ten vorkommen und spezifisch von Bindungs- partnern erkannt werden.“ Minderheitenkonformere tragen nur mit Zehntel- bis Hundertstelprozenten zur Ge- samtpopulation bei. Entsprechend herausfor- dernd ist ihre Vermessung. Ihr direkter Nach- weis gelingt auch mit der NMR nicht. Linser erklärt aber: „Grundzustands- und Minderheitenkonformere tauschen inbioenzy- matischen Prozessen oft imMikro- bis Millise- kunden-Bereich hin und her. Jede Konforma- tion hat für jeden Atomkern eine spezifische chemischeUmgebungund somit Resonanzfre- quenz zur Folge. Wechselt die Konformation, ändert sich auch die Resonanzfrequenz eines betroffenen Atomkerns. Die Summe aller Fre- quenzen bildet gewichtet nach den Häufigkei- ten ihrer Konformation das Gesamt-NMR-Si- gnal.“ Der Einfluss dieses chemischenAustauschs auf das NMR-Signal lässt sich mit bestimm- ten Pulssequenzen unterdrücken, fährt Lin- ser fort: „Da sich chemische Austauschpro- zesse zwischen Konformationen verschie- den schnell abspielen können, klopfen die einzelnen NMR-Techniken unterschiedliche Zeitskalen ab. Für langsame Prozesse im Be- reichweniger Hundert Mikrosekunden bis vie- ler Hundert Millisekunden eignen sich Refo- kussierungspulse, während schnellere Prozes- se Spinlock -Pulse notwendig machen.“ Auf der Refokussierungsseite ist die Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Relaxati- onsdispersion (RD) die beliebteste Metho- de der Lösungs-NMR, bestätigt Linser. „Bei ihr werden 180-Grad-Pulse eingestrahlt, um den transversalen Magnetisierungsabfall des NMR-Signals zu refokussieren und die dest- ruktive Interferenz von Austauschprozessen hinauszuzögern. Das gelingt, wenn die Pulse dichter aufeinanderfolgen als der Austausch- prozess im Protein vonstattengeht.“ „Die Spinlock -Pulse der R1ρ-Relaxations- dispersion dagegen refokussieren Magneti- sierung nicht, sondern halten sie entlang ei- ner Richtung fest“, beschreibt Linser die zwei- te Art an RD-Pulssequenzen.„Dadurch verzö- gern auch sie denMagnetisierungsabfall, was ebenfalls umso besser funktioniert, je stärker die Pulse relativ zur Zeitskala des Austausch- prozesses sind.“ Infos zu seltenen Konformeren Warumstecken Lebenszeiten von NMR-Si- gnalen voller Informationen über Minderhei- tenkonformere?„Weil im Abfall des NMR-Sig- nals nicht nur der Grundzustand von Atomker- nen codiert ist“, weiß Linser. „In Abwesenheit vonMinderheitenkonformeren ändern sichRe- laxationsprofile bei stärkeren oder dichteren Radiofrequenzpulsen nicht. Tun sie es doch, ist mehr als eine Konformation vorhanden. Indem NMRler diese Abhängigkeiten der RD-Profile mit demBloch-McConnell-Gleichungssystem quantifizieren, können sie die Austauschraten, die Zeitskala des Konformationswechsels, die Häufigkeiten zugrundeliegender Konforma- tionen und die Unterschiede in ihren chemi- schenVerschiebungen extrahieren. Daraus las- sen sich Strukturänderungen hin zumunsicht- baren Zustand rekonstruieren.“ Wie Relaxationsdispersion unsichtbare Zu- stände messbar macht, demonstrierte zum Funktionale Konformere eines Biomoleküls existieren manchmal nur für Mikrosekunden, tragen nur Zehntelprozente zu dessen Konformationsensemble bei und bewegen ihre Atome nicht mal ein Ångström. NMR-Relaxationsdispersion macht sie sichtbar – in Lösung wie im Festkörper. Unsichtbare Konformere im Rampenlicht Neulich an der Bench (202): Festkörper-NMR

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